E' inserita all'interno del percorso dei Musei Vaticani.
L'attuale pinacoteca fu inaugurata nel 1932 nell'edificio progettato dall'architetto Luca Beltrami, appositamente per ospitare la pinacoteca, per volontà del papa Pio XI.
La sistemazione, che segue un ordine cronologico, inizia con la Sala I con opere del XII-XV secolo che presenta tavole di enorme pregio fra cui la Maria Maddalena del Veneziano, la Madonna col Bambino di Vitale da Bologna, il San Francesco e storie della sua vita di Giunta Pisano e il Giudizio universale dei frati Giovanni e Niccolò.
La Sala II con opere del XIII-XIV secolo è dedicata alla pittura gotica incentrata soprattutto sulla figura di Giotto e sui suoi seguaci. E' doveroso ricordare le Storie di santo Stefano di Bernardo Daddi, il Polittico Stefaneschi di Giotto, eseguito durante il suo soggiorno romano per conto del cardinale Stefaneschi e destinato ad ornare uno degli altari della primitiva basilica di San Pietro e altri dipinti di grande pregio quali il Redentore di Simone Martini, la Madonna del Magnificat del Daddi, la Natività di Giovanni di Paolo.
La Sala III con opere del XV secolo presenta il Beato Angelico con le Storie di san Nicola di Bari e le Stimmate di san Francesco, cui fanno da contrappunto alcuni bei dipinti di Filippo Lippi e di Benozzo Gozzoli.
La Sala IV con opere del XV-XVI secolo presenta Melozzo da Forlì con i frammenti dell’affresco che decorava l’abside dei Santi Apostoli raffigurante l’Ascensione, andato distrutto nel Settecento, e nella colossale pittura murale che decorava i primitivi ambienti della Biblioteca Apostolica, opera della seconda metà del XV secolo, dedicata alla Nomina di Bartolomeo Sacchi da parte di Sisto IV a prefetto della biblioteca.
La Sala V e la Sala VI con opere del XV secolo presenta opere di maestri stranieri, quali Lucas Cranach, autore di una drammatica Pietà dai tipici toni nordici, i polittici di Carlo e Vittore Crivelli.
La Sala VII con opere del XV-XVI secolo presenta la scuola umbra con opere come l’Incoronazione di Maria del Pinturicchio e la Madonna col Bambino e quattro Santi del Perugino.
La Sala VIII con opere del XVI secolo, dedicata a Raffaello, è una delle sezioni più celebri e interessanti dell’intera pinacoteca. Vanta capolavori d’indiscussa bellezza come la Trasfigurazione, una delle ultime opere dipinte dall’Urbinate, che ne ricevette la commissione nel 1517 da parte di Giulio de’ Medici, futuro Clemente VII; la Madonna di Foligno, realizzata per conto di Sigismondo Conti, segretario personale di Giulio II, e infine i dieci Arazzi, realizzati tra il 1515 e il 1516 da manifatture fiamminghe su disegno del maestro, un tempo esposti nella Cappella Sistina in occasione dei conclavi e delle ricorrenze più solenni.
La Sala IX con opere del XV-XVI secolo è dedicata ad un altro grande maestro, Leonardo, rappresentato dall’abbozzo di un quadro raffigurante San Girolamo: un’opera particolarmente significativa soprattutto perché rivela interessanti particolari sulla tecnica del chiaroscuro e sullo schema compositivo leonardeschi.
La Sala X con opere del XV–XVI secolo espone dipinti soprattutto appartenenti alla scuola veneta, tra cui emergono le figure di Tiziano, autore dell’intenso Ritratto del Doge Nicolò Marcello, e del Veronese.
La Sala XI con opere del XVI secolo è dedicata alla pittura del Manierismo toscano e romano con il Sacrificio d’Isacco del Carracci e l'Annunciazione del Cavalier d’Arpino.
La Sala XII con opere del XVII secolo, dedicata al barocco, offre alcuni dei suoi più grandi esponenti, primo fra tutti il Caravaggio di cui è possibile ammirare la Deposizione, da lui dipinta nei primissimi anni del Seicento, ma anche opere di Guido Reni come la Crocifissione di san Pietro e del Domenichino come la Comunione di san Girolamo.
Interessanti sono anche le sale successive dedicate alla pittura fra Sei e Settecento che vantano la presenza di opere di grandi artisti italiani particolarmente attivi a Roma, come Pietro da Cortona, Orazio Gentileschi, il Baciccia, ma anche maestri stranieri, come Poussin, Van Dyck e Rubens.